Figure 1 大脑和肌肉时钟基因对于昼夜节律行为和骨骼肌的功能是充分必要的

接下来，对10周或26周龄的WT、KO、muscle-RE、brain-RE和RE/RE小鼠肌肉转录组进行RNA-seq分析。主成分分析（PCA）显示，muscle-RE和RE/RE转录组与WT更接近，而brain-RE转录组与KO更相似[Fig.2A]。10周龄和26周龄muscle-RE小鼠的肌样本中均显示出核心时钟基因的表达，但没有表现出节律振荡（即Bmal1、Per1-3、Cry1-2、Rorc和Nr1d1）[Fig.2B]，这表明肌肉外周时钟不是完全自主的。在brain-RE小鼠中，只有10周龄小鼠Per1-2和Cry1-2以及26周龄小鼠Per1-2和Cry1在肌肉中表现出节律性表达。在RE/RE小鼠中，两个周龄的时钟核心基因与WT小鼠几乎表现出相同的幅度、相位和周期振荡[Fig.2B]。这表明，肌肉外周时钟不能自主发挥作用。相反，它依赖于大脑-肌肉时钟网络来驱动肌肉昼夜节律机制的振荡。因此，大脑与肌肉的交流是必要的，足以驱动肌肉昼夜节律机制的振荡。

Figure 2 脑-肌时钟的相互作用驱动核心时钟机制、节律功能和正确相位

只有当大脑时钟存在时（brain-RE）才检测到大量不同的肌肉节律转录物，说明肌肉中存在大脑驱动的、非Bmal1依赖的振荡[Fig.3A,B]。然而，这些大脑驱动的转录物发生了振幅和振荡相位的改变[Fig.3C,D]。在WT小鼠的肌肉组织中，观察到参与基本分子过程的转录物在休息时间（ZT0至ZT12）出现表达峰值[Fig.3E]。Brain-RE小鼠的肌肉组织表现出相位错位，相位峰值发生在活动期。然而，RE/RE小鼠则表现出与WT小鼠一样的正确排列[Fig.3E-G]。

为了评估肌肉脂质代谢失调，研究人员测量了休息和活动时间（分别为白天和晚上）肌肉中的脂滴密度（脂滴是肌肉脂肪酸代谢的主要贡献者，并在动物活动期间提供肌肉能量代谢的重要来源）。同样观察到，Brain-RE小鼠表现出脂质代谢的相位错位，而RE/RE小鼠显示出与WT相似的分布[Fig.3H]。肌肉在很大程度上依赖线粒体活动来实现其正确的生理功能。线粒体动力学的有效调节包括通过AMPK信号募集分裂调节因子动力蛋白相关蛋白1（DRP1）来提高线粒体分裂速率。这一过程对于通过线粒体通过自噬分离受损或功能失调的线粒体至关重要。一致地，来自RE/RE动物的肌肉表现出活化的DRP1、活化的AMPK和自噬，类似于WT小鼠。相反，在brain-RE小鼠中观察到线粒体过程的时间错位。因此，功能失调的线粒体可能导致26周龄muscle-RE和brain-RE小鼠中的肌肉过早衰老。这与新出现的概念一致，即功能失调的线粒体会在衰老过程中引发肌少症。肌肉的“守门功能”对于维持正常的日常代谢和稳态功能以及预防肌少症至关重要。

Figure 3 通过外周肌肉时钟介导肌肉组织的节律功能和相位