1 神经示踪技术

逆行跨突触示踪：向小鼠后肢胫骨前肌、腓肠肌注射表达 EGFP 的伪狂犬病毒，标记支配后肢肌肉的上游神经元，结合 ClearMap 技术完成全脑神经元分布分析。

顺行与逆行示踪联用：通过注射特异性 AAV 病毒，追踪下丘脑外侧区与脑桥网状核口部、内侧隔核和斜角带及脊髓间的神经连接通路。

单神经元投射组分析：对下丘脑外侧区神经元开展稀疏标记与全脑成像，依据神经元投射模式进行层级聚类分类。（见图1、2）

2 光遗传学与化学遗传学技术

光遗传学激活：在特定基因编辑小鼠的下丘脑外侧区注射靶向 AAV 病毒，通过光纤激光刺激目标神经元或神经末梢，观察小鼠运动行为的动态变化。

化学遗传学抑制：向特定基因编辑小鼠的脑桥脚核注射靶向 AAV 病毒，通过注射 CNO 抑制核团内谷氨酸能神经元，验证下丘脑外侧区 - 脑桥网状核口部通路的功能独立性。（见图1、2）

3 钙成像与电生理记录

光纤光度法：向下丘脑外侧区注射钙指示剂 AAV 病毒，记录自由活动小鼠在觅食、休息、进食等不同行为状态下，核团内神经元的钙信号变化。

单细胞记录：借助多电极阵列，在小鼠线性轨道行走过程中记录下丘脑外侧区神经元的放电活动，分析神经元放电与运动速度的关联特征。

肌电图记录：在小鼠后肢肌肉植入电极，记录下丘脑外侧区受刺激后，后肢肌肉的收缩反应情况。

5 基因操作与深部脑刺激技术

神经元消融：通过注射靶向 AAV 病毒结合白喉毒素，实现对下丘脑外侧区谷氨酸能神经元，以及向下脑桥网状核口部投射的下丘脑外侧区神经元的特异性消融。

意向门控深部脑刺激：结合脑机接口技术，通过解码运动皮层神经元的活动信号触发下丘脑外侧区的深部脑刺激，实现对目标核团的精准化刺激调控。

1 LHA 谷氨酸能神经元调控后肢运动

通过 PRV 示踪发现，LHA 是下丘脑内支配后肢肌肉的神经元密度最高的区域，且这类神经元主要集中在尾侧 LHA。光遗传学技术激活 LHA 的 Vglut2⁺神经元，可诱导小鼠产生强烈的运动行为，且运动强度与光刺激的频率、强度呈相关性；而激活 LHA 的 Vgat⁺神经元则无此运动诱导效应。单细胞记录结果显示，部分 LHA 神经元的放电率与小鼠运动速度呈正相关，这类神经元中多数为谷氨酸能神经元，且有部分神经元在运动起始前放电率已出现升高趋势。（见图1）

2 LHA 通过 PnO/MSDB 通路调控运动

经单神经元投射组分析，可将 LHA 神经元划分为多类及不同亚型，其中尾侧投射型神经元主要向 PnO 等脑桥区域投射，长距离投射型神经元中有部分可直接投射至脊髓。光刺激 LHA 直接投射至脊髓的神经元，无法诱导小鼠产生运动行为；而刺激 LHA 向 PnO 或 MSDB 的投射通路，均可启动小鼠运动，且不同通路触发的运动表现存在差异：MSDB 投射通路会触发小鼠高速逃逸样运动，PnO 投射通路则诱导小鼠产生温和的运动行为。通过化学遗传学抑制 PPN 谷氨酸能神经元后，LHA-PnO 通路仍可正常诱导运动，证实该通路具备功能独立性。（见图2）

3 LHA-PnO 通路特异性调控动机驱动型运动

觅食试验中检测发现，LHA Vglut2⁺神经元在小鼠运动起始时钙信号显著升高，进食过程中则呈降低趋势；而 LHA 内抑制性神经元在小鼠进食时被激活。特异性消融向 PnO 投射的 LHA 神经元后，小鼠在旷场试验中的基础运动能力无明显异常，但在觅食试验中进入区域中心的次数和总移动距离均显著减少，且该操作未对小鼠食欲产生影响。高架十字迷宫与旷场试验结果显示，刺激 LHA-PnO 通路不会引发小鼠的焦虑样行为，而刺激 LHA-MSDB 通路则会导致小鼠出现焦虑相关的行为反应。

4 LHA-PnO - 脊髓通路介导 SCI 后运动恢复

脊髓损伤模型构建后，短期观察发现 LHA 神经元的 PRV 标记量显著减少；慢性期时，尾侧 LHA 的标记神经元数量出现恢复，提示 LHA 与脊髓之间的神经连接可在脊髓损伤慢性期完成重建。特异性消融 LHA 谷氨酸能神经元，或向 PnO 投射的 LHA 神经元后，脊髓损伤小鼠的后肢伸展、回缩等运动相关参数均显著受损，同时伴随明显的觅食行为障碍。光遗传学激活 LHA Vglut2⁺神经元，可即时改善脊髓损伤小鼠的后肢运动功能，显著提升其体重支撑能力与步幅长度。（见图3）

5 优化 DBS 策略促进严重 SCI 后的运动恢复

针对 LHA 不同亚区的定位刺激研究发现，刺激尾侧 LHA 可优先激活 PnO，刺激嘴侧 LHA 则优先激活 MSDB，据此选择尾侧 LHA 作为深部脑刺激的靶点，可有效避免刺激引发的焦虑样副作用。对严重脊髓损伤小鼠实施尾侧 LHA 的急性深部脑刺激，干预后中期小鼠后肢运动的相关运动学参数已显著改善，且该改善效应可长期维持。采用结合脑机接口的意向门控长期深部脑刺激策略，通过解码运动皮层神经元活动触发 LHA 深部脑刺激，对严重脊髓损伤小鼠进行长期规律性刺激后，其运动功能评分显著提升，后肢自主运动能力得到有效恢复，且整个刺激过程未引发小鼠明显的应激反应。（见图4）