细胞培养过程中的在线氧含量监测

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细胞培养过程中的在线氧含量监测

来源: | 作者:康森特生物科技 | 发布时间: 2023-12-05 | 386 次浏览 | 分享到:

哺乳动物细胞培养物中氧气和pH的实时测量对于了解细胞培养物的代谢动力学非常重要。SDR SensorDish Reader® 可根据环境条件或毒理学损伤，跟踪细胞耗氧量的时间过程。这种类型的监测对组织工程和干细胞研究等其他应用也有价值。

图 1：用于在线监测24孔多培养皿中溶解氧和pH值的SDR SensorDish® Reader

SDR SensorDish® Reader（图1）可对24孔微量滴定板中的氧气和pH值进行非侵入式在线监测。在本研究中，SDR用于监测以4种不同细胞密度和不同氧张力（19%O2（图2）和7%O2（图3））。此外，还评估了线粒体调节剂对氧气消耗率的影响(图4)。以小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）为代表性哺乳动物细胞类型，以羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）为代谢解偶联剂，抗霉素为电子传递链抑制剂。

一

材料与方法

小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）细胞在具有集成氧传感器（OxoDishes®）的24孔多培养皿中生长。在标准细胞培养条件（5%CO2、35%湿度和37°C）下，将细胞维持在有10%热灭活胎牛血清（FBS）、1%青霉素（10000 U/ml）/链霉素（10000µg/ml）、1%L-谷氨酰胺（200mM）、1%非必需氨基酸（10mM）和1%1M HEPES（pH 7.8）的Dulbeco改良的Eagle培养基（DMEM）中。在所有情况下，细胞在Coy O2控制手套箱中的1ml培养基/孔中生长。在整个培养期间，使用SensorDish®Reader软件按预设间隔监测培养基中的氧浓度。

二

细胞密度的影响

第一个实验旨在研究细胞密度对细胞耗氧率和随后培养基中pO2水平的影响。MEF细胞以三种不同的浓度(100,000;33,000;和10,000个细胞/cm2)以及“仅介质”控制。在接近大气中的氧气水平(约为19% O2)下，每2分钟测量一次，持续10小时。氧分布(图2)清楚地显示了细胞密度对每个处理的氧消耗水平的影响。观察到的滞后时间< 1小时，推测系统正在与温度和氧气水平平衡。在此之后，所有细胞浓度都显示出与“仅培养基”对照孔相比pO2水平的下降。最后，在孵育过程中，与“仅培养基”控制孔的偏差与最初接种的细胞数量成正比，这意味着个体细胞呼吸在所有测试的细胞密度下都是等效的。

图2：不同密度MEF细胞培养液中pO2的平均水平(100,000;33,000;10,000和0细胞/cm2)，并暴露于约19% O2;每组N = 3

第二个实验旨在研究低氧环境对第一个实验中细胞密度诱导观察的影响。MEF细胞以三种不同的浓度(100,000;33,000和10,000细胞/cm2)以及“仅培养基”控制，然后放置在7% O2的环境中，每5分钟监测一次，持续10小时。氧气分布证实了细胞密度对每次处理的氧气消耗水平的影响(图3)。观察到短时间的温度平衡(<1小时)，之后培养基中的剩余氧气被细胞以密度依赖的方式消耗。即使是“仅介质”在10小时后也不能在7% O2的新氧水平下完全平衡。然而，每次处理与“仅培养基”控制孔的偏差与所接种细胞的数量成正比。

图3：不同密度MEF细胞培养液中pO2的平均水平(100,000;33,000;10,000和0细胞/cm2)，暴露于7%的O2;每组N = 3

三

线粒体调节剂的作用

第三个实验旨在研究特定线粒体调节剂对细胞耗氧量和随后培养基中pO2水平的影响。MEF细胞以33,000个/cm2的速度接种，在培养皿上粘附4小时。然后将培养基替换为含有1µl/ml二甲亚砜(DMSO，对照物)的特定培养基;10µM羰基氰化物间氯苯腙(CCCP);或10µM抗霉素。然后在每个孔上加1ml矿物油，在标准培养条件下(5% CO2, 35%湿度，37°C, 19% O2环境)孵育平板，每2分钟监测一次，持续10小时。氧谱显示了处理对细胞耗氧量水平的显著影响(图4)。从3到4小时时间点的测量表明，在接受有剂量的培养基之前，处理的变化很小。在给药30分钟内，两组之间的耗氧量曲线出现了可观察到的差异。DMSO对MEF细胞的平均氧含量变化不大。在约17.5% O2的条件下，形成了耗氧和吸氧之间的稳定状态。抗霉素是电子传递链络合物III的抑制剂，可以明显降低细胞的耗氧速率，使细胞处于比DMSO更高的稳态。最后，CCCP(一种线粒体解偶联剂)治疗导致细胞耗氧量明显增加。

图4：抗霉素、DMSO和CCCP作用4小时时MEF细胞培养液中pO2的平均水平;每组N = 4

四

结论

使用SDR SensorDish® Reader，我们监测了哺乳动物细胞培养物中的培养基氧含量，并显示了细胞密度依赖性耗氧量。在19%O2、7%O2下都能观察到密度依赖性差异，这是一个更具生理相关性的氧气水平。另外，不含细胞的细胞培养基在7% O2条件下需要10小时以上才能达到平衡。因此，建议在所需的氧气水平下对培养基进行预孵育。最后，与对照组相比，CCCP增加了细胞需氧量，而抗霉素则减少了细胞需氧量。SDR SensorDish® Reader可以持续快速地定量介质氧水平，可用于测量细胞需氧量和代谢功能。