在造血干细胞/祖细胞（HSPC）培养过程中监测实时氧气的非侵入性方法
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作者:康森特生物科技
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发布时间: 2023-12-27
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造血祖细胞和血管祖细胞首先在低氧环境下的早期胎盘中发现，胎盘含氧量异常会影响胎儿的生长发育，研究氧气浓度对胎盘生长和血管发育的影响是极其重要的。
Presens的SDR SensorDish®Reader可以在从人脐带血中分离的造血干细胞/祖细胞（HSPC）培养过程中对体外氧浓度进行定量。在实时监测细胞培养液中氧浓度的同时，检测模拟生理氧浓度对HSPC增殖、细胞周期状态以及干细胞表型或分化细胞类型标志物表达的影响。这项研究证明了该系统在有效模拟体内氧气环境的条件下检测细胞表型和功能的有效性。
从人脐带血中分离的CD133 HSPC细胞在24孔OxoDish®中培养长达一周。每隔2-3天，取出细胞和培养液，短暂离心(1500rpm；5min)，并将细胞仔细地悬浮在适当氧浓度（1%、8% 或 20%）预孵育1h的培养液中。在这项细胞培养研究中，低氧环境是使用插入传统CO2培养箱(图1)的缺氧室实现的。在整个孵育期内，用SDR在线监测实时氧浓度。同时，在相同条件下，根据测定方法，在24孔板或6孔板中培养HSPC细胞。更换介质时，取出等分试样并使用计数器确定细胞数。在生理氧浓度(1%或8%)或环境氧浓度(20%)培养条件下，流式细胞仪测定DNA含量可用于检测HSPC细胞周期状态。同样，使用凋亡试剂盒(BD)结合流式细胞术对细胞凋亡水平进行量化。在蛋白质水平，用多参数流式细胞术分析干/祖细胞或分化细胞的胞外标志物的表达模式(结果未显示)。
图1：SDR用于监测HSPC培养过程中的体外氧浓度，将SDR连接到计算机（B）允许在实验期间对HSPC培养基中的氧浓度进行非侵入性实时测量。
图2显示了在各种氧气环境中进行为期两天的 HSPC 培养期间，SDR和OxoDish®联合测量的体外氧分压。HSPC在1%O2中培养时的平均氧分压为10.2(±5.5)mm Hg，在8%O2中培养时的平均氧分压为65.0(±7.5)mm Hg。在常氧(20%O2)中，HSPC培养液的平均氧分压为157.9(±9.2))mm Hg。为了获得相对稳定的低氧环境，每隔24小时，每小时更换一次大气，持续3小时。在高氧环境中，HSPC的增殖速度加快。HSPC生长曲线以氧浓度依赖性方式下降，在含有1%O2的环境中细胞增殖最低(图3)。流式细胞仪分析HSPC DNA含量可用于分析细胞周期状态。这项研究的结果清楚地表明，当环境中的氧气浓度降低时，处于休眠状态(如G0)或处于G1期的细胞数量显著增加。在本实验中，氧浓度似乎对HSPC的凋亡没有显著影响(数据未显示)。综上所述，这些结果表明，当HSPC在模拟体内环境的条件下培养时，细胞增殖下降，很可能是由于静息细胞(G0)的数量增加，对细胞死亡没有任何显著影响。本研究证实了氧浓度对干/祖细胞表型和功能有一定影响的证据，并进一步证实了氧在胎盘发育中起关键作用的观点。
图2：在含有低氧(1%或8% O2)和常氧(20% O2)的氧气环境中进行为期两天实验期间，测量的HSPC培养基的实际氧张力
人类胎盘发育不同时间点的生理氧浓度可以使用含有1%或8%的O2(5%CO2)两种不同的混合气体精准有效地模拟。本研究中SDR与Presens的OxoDish®配合使用进行的测量提供了额外的证据，证明在大气氧气(20%O2)中进行的传统细胞培养可以创造一个明显的高氧环境，其氧分压远高于人体组织中的正常pO2。在胎盘研究中使用低氧混合气体与之不同的是以前的研究不包括非侵入性、实时的氧气监测。这项调查清楚地表明，低氧细胞培养系统中的氧浓度处于恒定的流动中，很难维持在生理水平。因此，需要对实验参数（例如细胞数量、培养基成分、气体置换间隔等）进行标准化和广泛的测试，以确保达到并随后维持实际的生理氧浓度。使用标准化的方案，减少了试验之间的变异性。此外，SDR氧气监测系统在整个实验期间提供了关于体外氧气水平的可靠数据。这项研究的重复性结果表明，氧浓度、细胞增殖和细胞周期状态之间存在明显的联系。这些结果对干细胞/祖细胞培养和功能的意义将在未来详细研究。SDR为进一步的体外研究打开了可能性，在这一研究中，明确的、与生理相关的氧浓度和稳定的细胞培养条件发挥着重要作用。此外，可以根据实验监测和改变介质变化或氧气浓度的变化。使用该系统，可以及时达到研究目标，从而降低研究成本。
Timothy McKinnon1, Nelli Baal2, and Marek Zygmunt2
1Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, Toronto, Canada
2Universitätsklinikum Gießen und Marburg, Germany
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