研究人员建立安慰剂镇痛条件性训练实验（APC）模拟安慰剂镇痛效应，在适应期小鼠可自由穿梭在两个底部30℃（非伤害性刺激）的箱子，经过三天适应后进行训练期，1号箱子底部区域48℃（伤害性刺激），2号箱子底部区域30℃，经过三天训练后小鼠停留在2号箱子区域时间增多，在测试期1和2号箱子底部区域均为48℃，检测小鼠在1号和2号箱中的停留时间，结果发现小鼠在2号箱停留时间显著增多。此外，经过APC训练后小鼠在接受伤害性刺激（48℃）后首次出现舔舐前爪、首次直立、首次跳跃的潜伏时间均比未接受训练的小鼠延长，表明APC可产生期望依赖的镇痛作用。

通过Fos-CreERT2工具小鼠发现APC训练后吻侧前扣带皮层(rACC)神经元活性显著增加，病毒示踪工具rACC激活的神经元主要投射到纹状体、未定带区、脑桥核（PN）、背内侧丘脑，其中PN接受的输入最多。利用光纤钙成像记录系统发现rACC→PN环路神经元钙离子活性在训练期间逐渐升高，在测试期间钙离子活性也显著升高。电生理实验发现APC训练后rACC→PN神经元放电频率增加，自发性兴奋性突触后电流增强，诱发的长时程增强作用更强，前馈抑制作用减弱。

测试期间光抑制rACC→PN环路可阻断APC产生的镇痛作用。在热板实验中光抑制rACC→PN环路缩爪潜伏期减少，激活该环路后小鼠缩爪潜伏期延长。在机械性刺激中光抑制上述环路缩爪频率增加，激活该环路缩爪频率减少，表明rACC→PN环路参与APC引起的镇痛作用。

图2、rACC→PN环路参与APC引起的镇痛作用

单细胞测序实验发现Pn脑区约72%神经元为兴奋性神经元，约一半的神经元表达Oprd1 (编码δ-阿片类受体），仅26%神经元表达Oprm1  (编码μ-阿片类受体）。病毒示踪实验发现rACC投射到Pn-Oprd1神经元，光抑制Pn-Oprd1神经元可取消APC引起的镇痛作用。药理学实验也发现δ-阿片类受体和μ-阿片类受体激动剂均能阻断APC引起的镇痛作用。此外，光抑制Pn-Oprd1神经元可增加小鼠机械性和热觉敏感性。

图3、Pn脑区神经元表达阿片肽类受体